眾多研究和臨床實踐表明, 腦內(nèi)DA 系統(tǒng)與動物的運動、學(xué)習(xí)、記憶、情緒等活動有密切關(guān)系。帕金森病 ( Park in son ’ s d isease, PD ) 就是原因不明的黑質(zhì)DA 能神經(jīng)元變性丟失, 導(dǎo)致紋狀體內(nèi)DA 釋放量減少, 從而出現(xiàn)僵直、靜止性震顫和運動障礙等癥狀, 并伴有癡呆發(fā)生。目前PD 大鼠模型大多以**誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)實驗作為建模成功與否的觀察指標(biāo), 但此時黑質(zhì)DA 能神經(jīng)元丟失80% 左右, 紋狀體DA 含量下降超過 90% , 相當(dāng)于臨床PD 晚期。利用開野實驗作為行為學(xué)觀察指標(biāo), 動態(tài)觀察黑質(zhì)DA 能神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化與行為改變之間的關(guān)系, 相關(guān)報道還不多見。本實驗利用 6-O HDA 特異毀損大鼠單側(cè)黑質(zhì)DA 能神經(jīng)元, 在不同時間點觀察DA 能神經(jīng)元的病理變化, 丟失比例和行為學(xué)改變, 分析兩者之間的相關(guān)性, 以期為 PD 早期模型提供行為學(xué)評價指標(biāo), 為 PD 早期病理改變和神經(jīng)生化研究提供指導(dǎo)。
1 材料與方法
1. 1 儀 器 及 主 要 試 劑 腦立體定位儀 , 微量推進器 , SuperMaze動物行為圖像分析系統(tǒng) , 曠場實驗箱，6-O HDA 、酪氨酸羥化酶 抗體 , SABC、 DAB 。
1. 2 實驗動物及分組 健康 Sp rague2 D aw ley雄性大鼠 60 只 ( 安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供) ,體重 210 ～ 240g , 隨機分為正常對照組 ( N C ) ( n =10) , 實驗對照組 ( EC ) ( n = 10) , 和實驗組 ( n = 40) ,后者按處死時間不同隨機分成 4 組, 每組 10 只。
1. 3 6-O HDA 毀 損 7% 水 合 氯 醛 ( ip ,350 m g/kg ) 麻醉大鼠, 頭顱水平位固定在腦立體定位儀上, 門齒溝平面比耳間線平面低2. 4 mm , 剪去頭部毛, 切開頭皮, 暴露顱骨前囟點 ( 若不清晰, 可用3% H 2 O 2 擦洗) , 參照包新民等
著《大鼠腦立體定位 圖 譜》確 定 右 側(cè) SN c 區(qū) 坐 標(biāo) 前 囟 后 (A P )- 5. 2 mm , 右側(cè)旁開 (R ) 1. 3 mm , 深度 ( V ) 8. 0 mm ,顱骨鉆孔后 ( 切勿損傷軟腦膜) , 1L l 微量注射器插入右側(cè)SN c 區(qū), 注射8g /L 6-O HDA ( 溶于0. 2% V itC 生理鹽水溶液) 1L l, 利用微量推進器緩慢推進 ( 0. 5L l/m in ) 。注射完畢, 留針5 m in 后緩慢拔針, 縫合皮膚并肌注硫酸慶大霉素 ( 5 m g/kg ) 預(yù)防感染, 清醒后置籠喂養(yǎng)。 EC 組僅注射0. 2% V itC 生理鹽水溶液1L l , N C組不手術(shù)。
1. 4 開場實驗 (op en 2 f ield test )
敞口木箱60cm ×60cm ×40cm , 里面涂成黑色, 箱底劃為 25 個方格 ( 12 cm ×12cm ) , 將大鼠放入正中一格, 10 s 后開始記錄 15 m in 內(nèi)各項行為指標(biāo)。觀察指標(biāo): ( 1) 旋轉(zhuǎn)行為, 記錄左、右側(cè)旋轉(zhuǎn)的圈數(shù), 按公式右側(cè)/( 左側(cè)+ 右側(cè)) 計算不對稱指數(shù); ( 2) 探究行為, 鼻子距離箱壁 5cm 以內(nèi)的跑動時間; ( 3) 穿梭距離, 規(guī)定時間內(nèi)跑動的格子數(shù) ( 二爪以上跨入鄰格為跑動一格) ;( 4) 下肢站立, 雙上肢抬起離地 1cm 以上的次數(shù); ( 5)修飾次數(shù), 理毛、洗臉、舔舐次數(shù)。在毀損術(shù)后1d 、 3d 、5d 、 7d 、 14d 、 21d 各觀察 1 次, 每次實驗均在 7: 00 ～12: 00 AM 進行, 實驗室內(nèi)暗光、安靜, 兩次實驗之間將箱底打掃干凈。
1. 5 形態(tài)學(xué)觀察
1. 5. 1 取材 分別在術(shù)后 1d 、 7d 、 14d 、 21d 行為學(xué)測試完畢, 7% 水合氯醛 ( ip , 350 m g/Kg) 麻醉大鼠, 置于冰盤上, 打開胸腔, 暴露心臟, 先用 0. 9%N aC l 100 m l 經(jīng)心臟沖洗, 然后300 m l 4% 多聚甲醛灌注固定, 取出腦組織4% 多聚甲醛后固定24h。在針道旁冠狀面切開, 石蠟包埋, 連續(xù)切片, 片厚 6L m , 常規(guī)H E 染色。定位不在SN c 區(qū)的大鼠從該組剔除, 不進行統(tǒng)計學(xué)分析。
1. 5. 2 N issl 染色 切片脫蠟至水, 0. 1% 硫堇冰醋酸水溶液染色15 ～ 20 m in, 95% 酒精快速分色 ( 2～ 3 s 即可) , 脫水、透明、封片、鏡檢。
1. 5. 3 **組織化學(xué)染色 ( ABC 法) 切片脫蠟至水后經(jīng) 3% H 2 O 2 滅活內(nèi)源性過氧化物酶, 微波抗原修復(fù) 2 次, 正常山羊血清封閉 20 m in 后, 1 ∶500TH 一抗 4℃冰箱孵育過夜, 滴加生物素化二抗和 SABC 37℃各孵育 20 m in。其間, 各步驟間均用0. 01 mo l/L PBS (pH 7. 2) 充分洗滌, *后加DAB 顯色 ( 鏡檢控制顯色時間) , 常規(guī)脫水、透明、封片、鏡
檢。
1. 5. 4 電鏡觀察 灌注固定后, 分離黑質(zhì)和紋狀體約 1 mm
3, 2. 5% 戊二醛、 1% 鋨酸雙重固定, 脫水, Epon 812 包埋, L KB- NOVA 切片機超薄切片,醋酸鈾枸櫞酸鉛雙重染色, 透射電鏡觀察。
1. 5. 5 圖像分析 采用江蘇捷達圖像分析系統(tǒng)對切片進行圖像分析, 根據(jù)N issl 染色圈出黑質(zhì)范圍, 采用同一放大倍數(shù) ( ×100) , 同一光強度下測量陽性數(shù)密度, 并按照公式: 100- ( 右側(cè)細胞數(shù)/ 左側(cè)細胞數(shù)) ×100, 計算DA 能神經(jīng)元毀損程度。
1. 5. 6 統(tǒng)計方法 所有數(shù)據(jù)采用X ±s 表示,SPSS11. 5 統(tǒng)計軟件進行分析, 采用單因素方差分析( ANOVA ) 進行組間比較, *小有意義差異 t 檢驗( L SD -t) 進行組內(nèi)兩兩比較, 開野實驗各參數(shù)與黑質(zhì)DA 能神經(jīng)元毀損比例作 Pear son’ s 相關(guān)分析。
2 結(jié) 果
2. 1 開場實驗結(jié)果 ( 1) 旋轉(zhuǎn)行為: 組間比較差異有顯著性 (P < 0. 05) 。在術(shù)后 1d 右側(cè)旋轉(zhuǎn)行為增多 ( 與對照組比較P < 0. 05) , 3d 、 5d 恢復(fù)到對照組水平 ( P > 0. 05, 與 1d 、 14d 、 21d 組比較 P <0. 05 ) , 而后右側(cè)旋轉(zhuǎn)又逐漸占據(jù)優(yōu)勢 ( 14d 、 21d 組與對照組比較 P < 0. 05) ; ( 2) 探究行為: 組間比較差異有顯著性 (P < 0. 01) 。術(shù)后 1d 較對照組大幅減少( P < 0. 01 ) , 3d 、 5d 接近對照組水平 ( P > 0. 05, 與1d 、 7d 、 14d 、 21d 組比較 P < 0. 01 ) , 此后逐漸降至較低水平 ( 與對照組比較 P < 0. 01) ; ( 3) 穿梭距離: 組間比較差異有顯著性 ( P < 0. 01) 。實驗組變化趨勢呈正態(tài)分布, 1d 、 14d 、 21d 組與5d 組及對照組比較差異有顯著性 (P < 0. 01) , 5d 組與對照組比較差異無顯著性 ( P > 0. 05 ) ; ( 4) 下肢站立: 組間比較差異有顯著性 (P < 0. 01) 。各實驗組與對照組比較差異均有顯著性 (P < 0. 01) , 3d 、 5d 組也有恢復(fù)傾向 ( 與 1d 、21d 組比較 P < 0. 05 ) , 但與對照組相比仍處于較低水平; ( 5) 修飾行為: 變化沒有規(guī)律性, 組間比較差異
無顯著性 (P > 0. 05) 。
2. 2 形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 ( 1) H E 染色和N issl 染色顯示, 從 1d ～ 21d 大鼠 6-2 O HDA 注射側(cè)SN c 區(qū)神經(jīng)元較對側(cè)明顯減少, 尼氏體著色較對側(cè)淡, 針道及毀損區(qū)可見不同程度膠質(zhì)細胞浸潤, 對照組左右側(cè)細胞數(shù)均無明顯變化。( 2) **組化染色顯示 , TH 陽性神經(jīng)元隨時間推移逐漸減少, 毀損比例不斷增大, 沒有恢復(fù)傾向, 對照組無明顯變化。( 3) 電鏡結(jié)果從1 ～ 21d 大鼠黑質(zhì)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)損傷逐漸加重, 線粒體腫脹、嵴
消失, 粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體也有腫脹; 21d 神經(jīng)元水腫, 游離核糖體減少, 溶酶體增多; 在紋狀體則有髓鞘松解斷裂, 突觸小泡多為清亮型, 顆粒小泡極少甚至看不見。
2. 3 相關(guān)分析結(jié)果 旋轉(zhuǎn)行為與黑質(zhì)DA 能神經(jīng)元毀損比例呈正相關(guān) ( r = 0. 471, P < 0. 01) ; 探究行為、穿梭距離、下肢站立行為均與毀損比例呈負相關(guān) ( r = - 0. 719 、 - 0. 594 、 - 0. 589, P < 0. 01 ) ; 修飾行為與毀損比例無相關(guān)性( r= - 0. 227, P > 0. 05) 。
3 討 論
DA 作為內(nèi)源性神經(jīng)遞質(zhì)作用于基底核 ( basalgang lia) 的 D 1 、 D 2 受體, 平衡調(diào)節(jié)基底核為中心的直接和間接神經(jīng)回路功能。基底核并不發(fā)布對肌肉收縮的命令, 而是通過選擇不同的神經(jīng)元發(fā)放電活動,參與隨意運動的程序編制和運動程序的執(zhí)行, 在調(diào)節(jié)運動的組成、方向、順序、速度和幅度等方面發(fā)揮其作用。 PD 由于 SN c 區(qū)DA 能神經(jīng)元退變, 導(dǎo)致紋狀體DA 含量下降, DA 對間接回路的去抑制和對直接回路的興奮兩種功能嚴(yán)重喪失, 導(dǎo)致運動障礙。本實驗的結(jié)果也顯示, 實驗組大鼠在毀損術(shù)后 1d 即有明顯行為學(xué)改變, 其中旋轉(zhuǎn)、探究、后肢站立和穿梭行為與黑質(zhì) DA 能神經(jīng)元丟失比例有很好的相關(guān)性,而正常對照組和實驗對照組大鼠的行為在實驗前后沒有明顯改變。腦內(nèi)DA 神經(jīng)系統(tǒng)具有一定的代償功能, 如 PD患者在出現(xiàn)臨床癥狀時 SN c 區(qū)DA 能神經(jīng)元丟失已達80% 以上, PD 模型大鼠由于 DA 受體超敏出現(xiàn) DA激動劑誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)運動等。在我們的行為學(xué)實驗中也觀察到這種代償現(xiàn)象, 開野實驗的旋轉(zhuǎn)、探究、后肢站立和穿梭行為指標(biāo)在術(shù)后 3d 、 5d 有趨于改善的
傾向, 其可能機制: ( 1) DA 更新率增加, 殘存的DA 能神經(jīng)元合成和釋放DA 的能力增強; ( 2)DA 受體超敏, 包括受體敏感性增強和受體數(shù)目的增加;( 3) 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的增強, 如 Gs 蛋白上調(diào), A C 酶活力提高, 細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶 ( ex tracellu larsignal2regu lated k inase, ER K ) 的活化等。我們的實驗未發(fā)現(xiàn)修飾行為與黑質(zhì)毀損比例有相關(guān)性, 但Ber r idge大鼠曠場實驗與黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的相關(guān)性研究
指出紋狀體在修飾行為的整合中起重要作用, 如果毀損雙側(cè)紋狀體前外側(cè)部, 則將打破修飾行為鏈。因此, 我們認(rèn)為毀損一側(cè)SN c 區(qū)只能導(dǎo)致一側(cè)紋狀體 DA 含量下降, 而健側(cè)紋狀體足以發(fā)揮代償作用, 保持修飾行為鏈的完整性。另外, 可能與環(huán)境變化、手術(shù)損傷、麻醉等外界因素和觀察時間不夠也有一定的關(guān)系。6-O HDA 即 2. 4. 52 三羥基苯乙胺, 是一種選擇性兒茶酚胺能神經(jīng)元化學(xué)毀損劑, 單獨或聯(lián)合注射到大鼠 SN c 、內(nèi)側(cè)前腦束 ( M FB ) 、紋狀體 (Cp u ) 、腹側(cè)被蓋區(qū) ( V TA ) 等不同腦區(qū), 選擇性地毀損DA 和N E能神經(jīng)元 ( 尤其對前者作用更顯著) 制作不同程度損害的PD 模型。其作用機制是: 6-O HDA 通過多巴胺轉(zhuǎn)運體進入 DA 能神經(jīng)元, 快速氧化生成氧自由基( O 2-和·O H ) , 抑制線粒體氧化呼吸鏈復(fù)合物É , 并激活 casp ase 啟動細胞凋亡, 從而導(dǎo)致黑質(zhì)DA 能神經(jīng)元丟失。在我們的實驗中, 6-O HDA SN c 區(qū)注射后24h 即有50% 以上的DA 能神經(jīng)元丟失, 而后隨時間推移毀損比例不斷增大。**組化切片經(jīng)N issl復(fù)染發(fā)現(xiàn), 非 DA 能神經(jīng)元形態(tài)完整, 數(shù)量并不減少,在早期甚至有增多現(xiàn)象, 這說明 6-O HDA 是一種實用可靠的特異性 DA 能神經(jīng)毒劑。但該法制作的模型仍屬于急性損傷完全毀損模型, DA 神經(jīng)元在注藥后4h 即可見丟失。若用**誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)實驗作為鑒定標(biāo)準(zhǔn), 一般為術(shù)后 2 ～ 3 周陽性, DA 神經(jīng)系統(tǒng)毀損已相當(dāng)嚴(yán)重, 不利于觀察輕中度毀損模型。許多研究指出, 對輕中度毀損模型的研究更有助于對臨床 PD 早期患者病理形態(tài)、神經(jīng)生化和輕度行為異常的了解,有 助于 PD 病因、發(fā)病機制和**、細胞移植及基因**的研究。因此, 建立一個敏感反映輕中度毀損的行為學(xué)觀測指標(biāo), 具有較大的現(xiàn)實意義。我們利用開野實驗對毀損早期的大鼠進行行為學(xué)的觀察, 發(fā)現(xiàn)術(shù)后 1d 各項指標(biāo)即已發(fā)生明顯改變, 并能很好地動態(tài)反映 DA 毀損程度。開野實驗不僅適用于輕中度毀損模型的觀測, 還能反映毀損早期機體的代償情況,并且各參數(shù)間可相互佐證, *大程度地減少主觀因素的影響。因此, 我們認(rèn)為開野實驗是一個很好的反映DA 神經(jīng)系統(tǒng)毀損程度的行為學(xué)觀察指標(biāo)。大鼠曠場實驗與黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的相關(guān)性研究。
